Гипоксия-индуцируемый фактор-1 (HIF-1) является ядерным фактором, необходимым для активации транскрипции в ответ на гипоксию [1], который регулирует несколько генов, участвующих в эритропоэзе, обмене железа, ангиогенезе и метаболизме глюкозы [2]. При ишемии головного мозга [3, 4], повторяющихся эпизодах гипоксии-реоксигенации [5] или ишемическом прекондиционировании [6, 7] у крыс повышается экспрессия этого транскрипционного фактора в головном мозге. Примечательно, что среди генов, экспрессия которых изменяется во время ишемии головного мозга, наибольший интерес представляет белок натрий-кальциевый транспортер-1 (NCX1), убиквитарный протеин клеточной мембраны, который регулирует клеточный гомеостаз кальция и натрия в головном мозге [8]. До настоящего времени только в нескольких исследованиях особое внимание уделяли регуляции экспрессии NCX1 в головном мозге на уровне транскрипции.

Таким образом, чтобы разобраться в механизмах, участвующих в регуляции экспрессии NCX1 на уровне транскрипции, мы изучали ген NCX1 в качестве мишени для транскрипционного фактора HIF-1 в головном мозге. С этой целью мы изучили мРНК NCX1 и экспрессию белка в нервных клетках с сайленсингом HIF-1 после кислородо-глюкозной депривации (КГД) или воздействия хлорида кобальта (CoCl2), т.е. в двух экспериментальных условиях, приводящих к активации HIF-1. Затем выявили наличие гипоксиязависимых элементов (HRE), чувствительных к КГД или CoCl2 на промоторе NCX1 головного мозга. Вслед за этим установили специфическое связывание HIF-1 с HRE на промоторе NCX1 головного мозга. Наконец выяснили, оказывает ли избыточная экспрессия NCX1, индуцированная HIF-1 в головном мозге, нейропротективное действие при ишемическом прекондиционировании в модели на животных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все рестрикционные эндонуклеазы и модифицирующие ДНК ферменты были приобретены в New England Biolabs или Invitrogen. Наборы генов-репортеров люциферазы и векторы приобрели в Promega. Синтетические олигонуклеотиды были предоставлены Primm. Среду Игла, модифицированную Дульбекко, и эмбриональную телячью сыворотку приобрели в Invitrogen. Малые интерферирующие двухцепочечные РНК олигонуклеотиды (миРНК) к человеческому HIF-1 (GenBank регистрационный номер NM_181054) были предоставлены Dharmacon. МиРНК к HIF-1α крыс (GenBank регистрационный номер NM_024359) и NCX1 крыс (GenBank регистрационный номер NM_019268) приобрели в Qiagen. Все известные реагенты самого высокого качества были приобретены в Sigma-Aldrich.

КГД

Препараты нейронов гиппокампа изготовили из тканей мозга 18-дневных эмбрионов крыс линии Wistar (Charles River, Calco, Милан, Италия), как описано ранее [9], и использовали в течение 10 дней. Нейроны культивировали в модифицированной среде Игла/F12, содержащей 30% глюкозы, 5% деактивированной эмбриональной телячьей сыворотки и 5% лошадиной сыворотки, L-глутамин (2 ммоль/л), пенициллин (50 ед/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл). Нейробластомные SH-SY5Y клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, с до бавлением 10% инактивированной на гре ванием эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина (100 ЕД/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), заменимой аминокислоты (0,1 ммоль/л) и L-глутамина (2 ммоль/л) – все из Invitrogen. SH-SY5Y клетки, дифференцированные с использованием 10 мкмоль/л ретиноевой кислоты в течение 48 часов, и нейроны гиппокампа подвергли КГД в течение 3 и 2 часов соответственно [9].

Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальная микроскопия

Описание процедур двойного иммуннофлуоресцентного окрашивания нейронов гиппокампа и SH-SY5Y клеток было представлено ранее [10]. Первичные антисыворотки против NCX1 (моноклональные антитела мыши, 1:400; Swant) или против HIF-1α (поликлональные антитела кролика, 1:3000; Novus Biologicals) инкубировали при 4 °С в течение ночи. Флуоресцентно-меченые вторичные антитела, Alexa 488-конъюгированный антимышиный иммуноглобулин G и Alexa 594-конъюгированный антикроличий иммуноглобулин G (каждый в разведении 1:200; Molecular Probes) инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Иммунофлуоресценцию изучали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 510 META (Carl Zeiss).

Анализ полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой

Все РНК экстрагировали с помощью тризола в соответствии с инструкцией поставщика реагента (Invitrogen). Первую цепь кДНК синтезировали из 5 мкг общей РНК с использованием системы первой цепи SuperScript для полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскриптазой. Полуколичественную ПЦР проводили при следующих условиях: 95 °С в течение 3 часов, 30 или 35 циклов реакции (95 °С в течение 1 часа, 48 °С в течение 1 часа, 72 °С в течение 1 часа) и 72 °C в течение 10 часов. Использовали следующие пары нуклеотидов: 5’-ACCACCAAGACTACAGTGCG-3’ и 5’-TTGGAAGCTGGTCTGTCTCC-3’ для NCX1 [11] и 5’-CCTGCTGGATTACATTAAAGCACTG-3’ и 5’-CCTGAAGTACTCATTATAGTCAAG-3’ для ге на гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы [12]. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Оптическую плотность полос определили путем проверки с использованием системы анализа изображений в геле (Chemi Doc Imaging System; Biorad). Показатели оптической плотности нормировали по полоске гена гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы, которую использовали в качестве внутреннего стандарта. Количественную ПЦР в режиме реального времени проводили с помощью набора реагентов SYBR green core reagent kit (Applied Biosystems) в 7500 быстрых системах ПЦР в режиме реального времени (Applied Biosystems). Образцы амплифицировали одновременно в трех экземплярах в рамках 1 серии анализа. Использовали следующие праймеры: 5’-TCCCTATAAAACCATTGAAGGCACA-3’ и 5’-TTTCTCATACTCCTCGTCATCGATT-3’ для NCX1 и 5’-TATCAGACTGAAGAGCTACTGTAATGACC-3’ и 5’-TTACCAGTGTCAATTATATCTTCAACAATC-3’ для гена гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы [13].

Экстракты содержимого клетки, цитоплазмы и ядра

Экстракты содержимого ядра и цитоплазмы получили методами, описанными ранее [14]. Для получения экстракта содержимого клеток, клетки сначала промывали фосфатно-солевым буфером, а затем соскабливали и центрифугировали при малых оборотах в ледяном лизирующем буфере (20 ммоль/л Hepes, 7,5 рН, 1% Тритон, 150 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л NaF, 1 ммоль/л Na3VO4, 0,5 мкг/мл апронитина, 1 мкг/мл леупептина, 1 мкг/мл пепстатина). Затем образец снова центрифугировали и супернатант использовали для проведения вестерн-блоттинга.

Вестерн-блоттинг

С помощью анализа Bio-Rad protein assay (Biorad) определили концентрацию белков. Для обнаружения целевых белков использовали специфические антитела: анти-HIF-1α (мышиное моноклональное антитело, 1:750; Chemicon); анти-NCX1 (кроличье поликлональное антитело, 1:1000; Swant), анти-CREB (мышиное моноклональное, 1:1000; Santa Cruz Biotechnology); анти-HIF-2α (кроличье поликлональное, 1:1000; Novus Biologicals);), а также анти-β-актин (мышиное моноклональное, 1:1000; Sigma). Иммунореактивность выявили с использованием антимышиного и антикроличьего иммуноглобулинов G, сопряженных с пероксидазой, в разведении 1:2000 (GE Healthcare) с помощью реагента ECL (GE Healthcare). Оптическую плотность полос определили с помощью системы Chemi Doc Imaging System (Biorad) и нормировали по оптической плотности β-актина.

Анализ сдвига электрофоретической подвижности

Мы разработали нерадиоактивную процедуру с использованием флуоресцирующих меченых красителем цианом (Cy5) олигодезоксинуклеотидных дуплексов в качестве специфических зондов. Cy5 была помечена на 5’-концах олигонуклеотидов (MWGBiotech AG). Комплементарные олигонуклеотиды ренатурировали в 50 ммоль/л Трис, рН 7,5, 10 ммоль/л MgCl2 и 5 ммоль/л DTT. Для анализа сдвига электрофоретической подвижности использовали следующие последовательности кодирующих нитей дуплексов: NCX1-HRE1wt: 5’-GGGCTGGGCTCGTGCGAGCCAGTG-3’; NCX1-HRE2wt: 5’-GCGGTGTGTACGCACTGCGG-3’; EPO HRE: 5’-GCCCTACGTGCTGTCTCACACAGC-3’ [15]; CREB: 5’-TCATCATTAGGCGTCAACACAGG-3’ [16]; NCX1-HRE1-mut: 5’-GCTGGGCTAAAGCGAGCCAG-3’; NCX1-HRE2-mut: 5’-GCGGTGTGTTTTCACTGCGG-3’.

Реакцию связывания провели в объеме 20 мкл с 5 мкг экстрактов ядра, 400 нг поли(dI-dC) (Roshe) и 1 пмоль Cy5-меченого зонда в буфере, содержащем 10 ммоль/л Hepes, рН 7,9, 100 ммоль/л KCl, 0,2 ммоль/л ЭДТА, 1 ммоль/л MgCl2 0,5 ммоль/л DTT и 10% глицерина. Исследование конкуренции проводили с различными концентрациями немеченой конкурирующей ДНК. Для анализа по методу supershift использовали 1 мкг антител против HIF-1, HIF-2, CREB или β-актина. Реакцию проводили на 5% неденатурирующем акриламидном геле в Трис-ЭДТА-боратном буфере (30 ммоль/л Трис, 30 ммоль/л борной кислоты, 0,6 ммоль/л ЭДТА). Гели сканировали при 600 V на аппарате для визуализации Typhoon 9400 с использованием зеленого лазера (633 нм) для возбуждения и эмиссионного фильтра 670BP30.

Анализ иммунопреципитации хроматина

Анализ иммунопреципитации хроматина и количественную оценку ПЦР в режиме реального времени проводили методами, описанными ранее [17]. Каждый образец подвергали иммунопреципитации в течение ночи при 4 °С с использованием 2 мкл мышиного моноклонального антитела к HIF-1α (Novus Biologicals) или 2 мкл мышиных антител к иммуноглобулину G в качестве негативного контроля в буфере (1,1% Triton,, 1,2 ммоль/л ЭДТА, 16,7 ммоль/л Трис, рН 8,1, 167 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л фенилметилсульфонилфторида, 1 ммоль/л Na3VO4, 300 нмоль/л трихостатина, 0,5 мкг/мл apronitin, 1 мкг/мл леупептина, 1 мкг/мл пепстатина). Квантование фрагментов осажденного хроматина в ходе ПЦР в режиме реального времени выполнили с набором реагентов SYBR green core reagent kit (Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями производителя. Для ПЦР использовали следующие праймеры, разработанные с помощью программного обеспечения Primer Express software (Applied Biosystems): Pr2fwd: 5’-CAGAGGAGACCCGGTGGTT-3’ и Pr2rev: 5’-CGCTACCCTCGGGTGCTT-3’. Относительное количество каждого фрагмента хроматина затем экстраполировали на основании пороговых значений их цикла и рассчитывали процентное отношение к общей ДНК. Для каждой амплификации кривые плавления и результаты электорофореза в геле продуктов ПЦР использовали с целью подтверждения их идентичности. Образцы амплифицировали одновременно в трех экземплярах в рамках 1 серии анализа.

Клонирование SLC8A1 участка промотора

Амплификацию с помощью ПЦР проводили с использованием Pfu ДНК-полимеразы (Stratagene) на геномной ДНК крыс, начиная с-1140 (5’-ATTTGAGTCCGCATCCCCAG-3’) и +250 (5’-TTGCTCGAGTAGGGAACCTCGAAGAGAGC-3’) эк зона Br-1 (GenBank регистрационный номер U95138). Амплифицированный фрагмент, соединенный с Taq ДНК полимеразой (Eppendorf), клонировали с помощью векторной системы pGEM-T Vector System, и его идентичность была подтверждена при анализе последовательности ДНК. Зону промотора субклонировали в pGL3basic векторе. Структуру репортера, содержащую более короткий сегмент, получили путем RsaI расщепления.

Трансфекция

Трансфекцию SH-SY5Y выполнили с использованием стандартного протокола преципитации фосфата Ca2+ [18]; 8×105 клеток на пластиковых планшетах диаметром 35 мм котрансфектировали с 2,4 мкг каждой плазмиды и 0,6 мкг контрольной плазмиды люциферазы renilla. Активность люциферазы выразили в виде соотношения плазмиды светлячка/плазмиды люциферазы renilla. Преципитат извлекали через 15 часов.

Трансфекцию нейронов гиппокампа проводили с использованием реагента HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen); 20 нмоль/л кодирующей миРНК (siCTL) или миРНК к HIF-1α (6 siHIF-1) смешивали с 10 мкл реагента трансфекции HiPerFect в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем добавляли к нейронам. Использовали два дополнительных HIF1-1α: 5 siHIF-1α и 7 siHIF-1α. После 2-часового инкубационного периода заменяли среду на свежую.

Анализ числа погибших клеток: окрашивание пропидиумом иодида

Гибель нейронов оценивали путем определения соотношения между мертвыми и живыми клетками. Для количественной оценки гибели клеток после экспериментальных процедур клетки промывали нормальным раствором Кребса и проводили двойное окрашивание путем добавления 36 моль/л флуоресцеина диацетата и 7 моль/л пропидиума йодида в фосфатный буферный раствор и экспозиции в течение 5 минут при 37 °С. Окрашенные клетки немедленно изучали с помощью стандартной микроскопии с обратной флуоресценцией при длине волны 480 и 546 нм [27]. Рассчитывали число пропидиум йодид-положительных и флуоресцеина диацетат-положительных клеток в трех полях зрения при большом увеличении в независимых культурах клеток. Гибель клеток определяли по соотношению: число пропидиум йодид-положительных клеток/число пропидиум йодид-положительных плюс флуоресцеина диацетатположительных клеток [27].

Анализ по гену-репортеру

Двойные анализы активности люциферазы выполняли в соответствии с инструкциями производителя (Promega). Активность люциферазы измеряли в 20 мкл клеточного лизата и регистрировали с помощью неавтоматизированного люминометра (Glomax 20/20, Promega).

Исследования in vivo: экспериментальные группы

Сто шестьдесят четыре самца крыс Sprague-Dawley (Charles River) весом от 250 до 300 г были помещены в условия циркадного режима освещения (по 12 часов темноты/света). Из них 50 штук погибли в ходе хирургического вмешательства или сразу после его проведения, 29 животных исключили из экспериментальных групп в связи с тем, что показатели мозгового кровотока не достигли установленного значения после индукции ишемии. Всех животных произвольным образом разделили на группы лечения. Все эксперименты были одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных Университета Федерико II, Неаполь, Италия.

Транзиторная очаговая ишемия и ишемическое прекондиционирование

Транзиторную очаговую ишемию индуцировали с помощью ранее описанной методики [19], выполнив окклюзию средней мозговой артерии (СМА) у самцов крыс путем введения кетгута в артерию под наркозом с использованием 1,5% севофлурана, 70% N2O и 28,5% О2. Наличие ишемии подтвердили путем мониторинга регионального мозгового кровотока с помощью лазерной допплерографии (PF5001; Perimed). Животных, у которых церебральный кровоток снизился меньше чем на 70%, исключили из исследования. Крыс разделили на 4 экспериментальные группы: (1) ложная операция (n=15), (2) ишемия (n=5), (3) прекондиционирование (n=5) и (4) ишемическое прекондиционирование (n=60; прекондиционирование и транзиторная окклюзия СМА – тОСМА). Ложно-оперированным животным провели те же процедуры, что и животным других экспериментальных групп за исключением введения кетгута в просвет артерии. В группе ишемии окклюзия СМА продолжалась 100 минут; в группе ишемического прекондиционирования крысам проводили тОСМА в течение 30 минут, а через 72 часа – тОСМА продолжительностью 100 минут. Всех животных умертвили через 24 часа после тОСМА продолжительностью 100 минут для количественного определения объема инфаркта или оценки уровня экспрессии белка. В частности, оценили экспрессию белка в коре головного мозга крыс всех четырех экспериментальных групп. Сорок пять из 60 крыс в группе ишемического прекондиционирования отобрали для проведения следующих процедур – введения миРНК для NCX1 (n=15) или HIF-1 (n=15), несколько животных использовали в качестве контрольной группы (n=15). Ректальную температуру поддерживали на уровне 37±0,5 °C. Некоторым животным установили катетер в бедренную артерию и с помощью анализатора газов крови определяли уровень газов артериальной крови до и после ишемии (Rapid laboratory 860; Chiron Diagnostic). Существенных различий в этих физиологических показателях между всеми экспериментальными группами не было (данные не представлены).

Оценка объема инфаркта

Животных умертвили путем введения изофлурана через 24 часа после тОСМА продолжительностью 100 минут. Мозг быстро извлекли, выполнили коронарные срезы с интервалом 1 мм и окрасили путем погружения в краситель для прижизненной окраски (2%) 2,3,5-трифенилтетразолиум гидрохлоридом. Объем инфаркта рассчитали путем суммирования зон инфаркта во всех срезах и умножения полученной суммы на толщину срезов. Процентное соотношение зоны инфаркта рассчитали путем деления объема инфаркта на общий объем ипсилатерального полушария. Величину отека рассчитали следующим образом: (объем полушария, ипсилатерального по отношению к очагу поражения)-(объем полушария, контралатерального очагу поражения). Этот показатель выразили в процентах от объема полушария, ипсилатерального по отношению к очагу поражения. Это процентное отношение вычли из объема инфаркта [20]. Эксперты, проводившие анализ изображений, находились в неведении относительно данных о принадлежности животных к той или иной экспериментальной группе.

Введение миРНК

Крысам, помещенным в стереотаксическую рамку, имплантировали канюлю 23-го калибра из нержавеющей стали (Small Parts) в правый боковой желудочек с использованием следующих стереотаксических координат: на 0,4 мм каудальнее брегмы, на 2 мм латеральнее и 2 мм ниже твердой мозговой оболочки [20]. Канюли зафиксировали на черепе с помощью стоматологического акрилового геля и винтиков. МиРНК (1 мкл, 0,3 моль/л) вводили в желудочек головного мозга за 24, 18 и 6 часов до индукции ишемического прекондиционирования.

Иммуногистохимия с однократным окрашиванием

Крыс подвергли глубокому наркозу с хлоралгидратом (300 мг/кг внутрибрюшинно) и провели транскардиальную перфузию 0,9% раствором хлорида натрия, а затем 4% вес/объем параформальдегида и 0,2% вес/объем пикриновой кислоты в фосфатном буфере в течение 30 минут. Ткани мозга извлекли, затем фиксировали в течение 3 часов в том же закрепителе и обработали в соответствии с ранее описанной методикой [10]. Использовали первичные антисыворотки NCX1 (1:500) и HIF-1α (1:2000). Пероксидазную реакцию провели с использованием 3,3’-диаминобензидина 4 HCl или Ni2+-усиленного 3,3’-диаминобензидина 4 HCl в качестве хромогена, и 0,05% H2O2. Изображения получали с помощью цифровой камеры (Coolsnap; Media Cybernetics), установленной на микроскопе Nikon Eclipse 400.

Статистический анализ

Данные оценивали как среднее±СОШ. Статистически значимые различия между показателями определяли с помощью ANOVA с последующим тестом Стьюдента-Ньюмана-Кейлса. Статистически значимыми считали показатели при значении р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Повышение экспрессии NCX1 и ядерной транслокации HIF-1 в нейронах гиппокампа в условиях КГД и в SH-SY5Y клетках, обработанных CoCl2

В условиях КГД в нейронах гиппокампа (в течение 2 часов) произошло значительное увеличение иммуносигнала HIF-1α в ядре (рис. 1А). Аналогичным образом при обработке SHSY5Y клеток 100 моль/л CoCl2 в течение 24 часов, что приводит к активации образования HIF-1 [21, 22], произошло диффузное и резкое увеличение содержания белка HIF-1 во всем ядре (рис. 1Б). Увеличение иммунореактивности фактора транскрипции сопровождалось выраженным повышением сигнала NCX1 на мембране клеток и в цитоплазме (рис. 1А, в, г; рис. 1Б, в’, г’). В отличие от этого, в условиях нормоксии иммуносигнал NCX1 был ограничен в основном нейропилями, в то время как иммунореактивность HIF-1α была едва заметна в цитоплазме и ядрах клеток гиппокампа или SH-SY5Y клеток (рис. 1А, а, б; рис. 1Б, а’, б’).

Рисунок 1. В условиях кислородо-глюкозной депривации (КГД) и при воздействии кобальта гипоксия-индуцируемый фактор-1 (HIF-1) транслоцируется в ядро и происходит повышение регуляции белка натрий-кальциевого транспортера-1 (NCX1) в клетках гиппокампа и SH-SY5Y клетках нейробластомы соответственно. Конфокальные изображения NCX1 (белый) и HIF-1 (серый) иммунореактивности в нейронах гиппокампа контрольной группы (A, а, б), необработанных SH-SY5Y клетках (Б, а’, б’), нейронах после КГД в течение 2 часов (А, в, г) и в SH-SY5Y клетках после воздействия хлорида кобальта (CoCl2) (Б, в’, г’). В нижнем ряду снимков показаны результаты двойного мечения при большом увеличении. Стрелками указаны сигналы иммунореактивности NCX1 в нейронах гиппокампа (A, а’, б’) и SH-SY5Y клетках (Б, а’, б’) контрольной группы или на плазматической мембране нейронов после КГД (A, в’, г’) и обработанных CoCl2 SH-SY5Y клетках (Б, в’, г’). Масштаб горизонтальной черты 10 мкм (А) и 20 мкм (Б)

HIF-1 и увеличение экспрессии белка NCX1 и транскриптов NCX1 в нейронах гиппокампа и SH-SY5Y клетках, подвергшихся КГД или воздействию CoCl2

Воздействие 100 моль/л CoCl2 в течение 24 часов на нейроны гиппокампа или SH-SY5Y клетки привело к увеличению экспрессии белка HIF-1 (рис. 2А). Кроме того, произошло увеличение содержания белка NCX1 и мРНК NCX1 в 1,6 раза (рис. 2А) и в 1,5 раза (рис. 2Б) в нейронах гиппокампа, в 1,7 раза (рис. 2А) и 2,4 раза (рис. 2Б) в SH- SY5Y клетках.

Рисунок 2. Воздействие хлорида кобальта (CoCl2) и кислородо-глюкозная депривация (КГД) приводят к увеличению количества генных продуктов белка натрий-кальциевого транспортера-1 (NCX1) и экспрессии белка гипоксия-индуцируемого фактора-1 (HIF-1) в нейронах гиппокампа и SH-SY5Y клетках. А – образец вестерн-блоттинга, демонстрирующий уровни белков HIF-1 и NCX1 после воздействия 100 мкмоль/л CoCl2 течение 24 часов в гиппокампе и SH-SY5Y клетках. Б – пример анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой, демонстрирующий уровни мРНК NCX1 после 24-часового воздействия 100 мкмоль/л CoCl2 в нейронах гиппокампа (верхний рисунок) и SH-SY5Y клетках (нижний рисунок) соответственно. В – образец вестерн-блоттинга, демонстрирующий уровни белков HIF-1 и NCX1 после 2 часов КГД в гиппокампе и SH-SY5Y клетках. Г – пример анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой, демонстрирующий уровни мРНК NCX1 после 2 часов КГД в гиппокампе (верхний рисунок) и SH-SY5Y клетках (нижний рисунок) соответственно. На диаграммах под каждым изображением представлено количественное содержание белков HIF-1 и NCX1 и уровни транскрипта NCX1 после воздействия CoCl2 и КГД, выраженное в процентном отношении к контрольной группе. * – р<0,05 по сравнению с контрольной группой. Каждый столбец представляет собой среднее±СОШ (n=3)

В условиях КГД произошло увеличение содержания субъединиц HIF-1α в нейронах гиппокампа и SH-SY5Y клетках (рис. 2В). Помимо этого содержание белка NCX1 и мРНК NCX1 увеличилось в 1,5 раза в нейронах гиппокампа (рис. 2В, Г), а также в 1,8 раза и 1,7 раза в SH-SY5Y клетках (рис. 2В, Г).

На промоторе NCX1 головного мозга есть два участка связывания HIF-1

Для изучения влияния увеличения мРНК NCX1 на синтез NCX1 путем повышенной регуляции активности его промотора выполнили компьютерный анализ последовательности промотора NCX1 головного мозга (GenBank регистрационный номер U95138). В частности, в базах данных TRANSFAC v. 3.2 выявили наличие 6 предполагаемых консенсусных участков HRE для HIF-1. Для выявления определенных консенсусных участков, участвующих в связывании HIF-1 с промотором NCX1 головного мозга, 2 различных фрагмента 5’-фланкирующих областей, расположенных на 5c от сайта инициации транскрипции NCX1 головного мозга (+1), были клонированы с 5c от гена люциферазы светлячка в векторе репортера pGL3basic без промотора. Первая конструкция, названная длинным NCX1 промотором (-1080/+151), содержала 1230 п.н. промотора NCX1 головного мозга. Вторая конструкция, названная коротким NCX1 промотором (-340/+151), содержала 350 п.н. (рис. 3А).

Рисунок 3. Гипоксия-индуцируемый фактор-1 (HIF-1) активирует промотор белка натрий-кальциевого транспортера-1 (NCX1). А – на диаграмме показана структура pGL3-основных векторов репортеров люциферазы, содержащих промотор NCX1 головного мозга различной длины. Предполагаемые чувствительные элементы HIF-1 (HRE) указаны в виде незакрашенных прямоугольников. Б – SH-SY5Y клетки, трасфектированные векторами, инкубировали с 50 мкмоль/л хлорида кобальта (CoCl2; серые столбики) или 100 мкмоль/л CoCl2 (черные столбики) в течение 24 часов. В – дифференцированные ретиноевой кислотой SH-SY5Y клетки подвергались кислородо-глюкозной депривации (КГД) в течение 3 часов (черные столбики). * – р<0,05 vs контрольная группа; ** – p<0,05 vs все экспериментальные группы. Каждый столбец представляет собой среднее±СОШ не менее 6 экспериментальных значений, полученных в 3 независимых экспериментальных сериях

После транзиторной трансфекции плазмид в клетки и контрансфекции плазмиды люциферазы renilla для нормализации эффективности трансфекции, исходная активность люциферазы существенно повысилась ≈в 10 раз в SH-SY5Y клетках, трасфектированных длинным NCX1 промотором (-1080/+151) и в 20 раз в клетках, трасфектированных коротким промотором (-340/+151), по сравнению с активностью люциферазы в клетках, трасфектированных пустым pGL3basic вектором (рис. 3Б, В). При воздействии CoCl2 происходило зависимое от концентрации увеличение активности люциферазы в SH-SY5Y клетках, трасфектированных длинным или коротким промотором NCX1 головного мозга. В частности, когда клетки подвергались воздействию 50 мкмоль/л и 100 мкмоль/л CoCl2 в течение 24 часов, активность люциферазы была несколько выше в клетках, трансфектированных коротким NCX1 промотором (в 1,6 и 2,8 раза соответственно), чем в клетках, трасфектированных длинным промотором (в 1,4 и 2,1 раза соответственно, рис. 3Б). Кроме того, хотя анализ зависимости от времени показал, что воздействие 100 мкмоль/л CoCl2 приводит к более высокому уровню активности люциферазы в течение 24 часов после лечения, статистически значимое увеличение регистрировали уже через 16 часов (данные не представлены). Чтобы в дальнейшем продемонстрировать влияние повышения уровня HIF-1 на активацию длинной или короткой формы промотора NCX1, дифференцированные ретиноевой кислотой клетки нейробластомы, трасфектированные короткой или длинной формой промотора NCX1 головного мозга, поместили в условия КГД на 3 часа. КГД-индуцированное накопление HIF-1 привело к повышению активности люциферазы в 1,9 раза в клетках, трансфектированных длинной формой, и в 2,3 раза в клетках, трансфектированных короткой формой (рис. 3В).

HIF-1 связывает HRE1 и HRE2 на промоторе NCX1 головного мозга

Поскольку делеция 4 HRE длинного промотора NCX1 не приводит к снижению кобальт-индуцированной активации NCX1, провели анализ сдвига электрофоретической подвижности и анализ иммунопреципитации хроматина на HRE1 и HRE2, которые являются двумя предполагаемыми HRE, расположенными на -164/-160 п.н. и -331/-327 п.н. на коротком промоторе NCX1. В частности, для анализа сдвига электрофоретической подвижности использовали 2 зонда: 24-п.н. 5’-Cy5 флуоресцирующий зонд (NCX1-HRE1), содержащий последовательность HRE1, и 20-п.н. 5’-Cy5 флуоресцирующий зонд (NCX1-HRE2), содержащий последовательность HRE2. Экстракты ядер SH-SY5Y клеток, ранее подвергшихся воздействию CoCl2 , инкубировали с NCX1-HRE1 флуоресцирующими зондами. В экстрактах ядра клеток, подвергшихся воздействию кобальта, обнаружили сложную структуру сдвига полос (рис. 4А, дорожка 2) по сравнению с необработанными клетками (рис. 4А, дорожка 1). Для проверки специфического связывания белка HIF-1 с флуоресцирующим зондом провели анализ конкуренции. Немеченый HRE1 олигонуклеотид полностью вытеснил люминесцентные NCX1-HRE1 комплексы (рис. 4А, дорожка 3); 2 основных специфических комплекса были устойчивы к конкуренции с немеченым мутантным олигонуклеотидом HRE1 (HRE1-mut), в котором предполагаемый сайт связывания HRE в HIF-1 был изменен (стрелка-указатель на рис. 4A, дорожка 4). Более того, когда в качестве конкурента использовали олигонуклеотид EPO-HRE, который содержит HRE из гена эритропоэтина (EPO), известную последовательность-мишень для HIF-1, образование специфических комплексов удалось полностью предотвратить (рис. 4А, дорожка 5). Образование специфических комплексов также значительно снизилось при наличии немеченого олигонуклеотида HRE2 (рис. 4А, дорожка 6). Для того, чтобы убедиться, что HIF-1 является ядерным белком, который фактически связывается с люминесцентным зондом NCX1-HRE1, провели анализ по методу supershift в геле. Использование моноклональных антител против HIF-1 позволило более существенно предотвратить образование специфических комплексов HRE1 по сравнению с анти-β-актин антителами, которые использовали в качестве контроля (рис. 4А, полосы 7 и 8).

Рисунок 4. Гипоксия-индуцируемый фактор-1 (HIF-1) связывает гипоксия-чувствительные элементы (HRE)-1 и HRE2 на промоторе белка натрий-кальциевого транспортера-1 (NCX1). Экстракты ядер SH-SY5Y клеток, которые подвергли воздействию 100 мкмоль/л CoCl2 в течение 24 часов, инкубировали с Cy5’-меченым NCX1-HRE1 зондом (А) или Cy5’-меченым NCX1-HRE1 зондом (Б). Анализ конкуренции проводили с немеченым HRE1 дикого типа (HRE1; А – дорожка 3, Б – дорожка 6), мутантным HRE1 (HRE1-mut; А – дорожка 4), HRE эритропоэтина (EPOHRE; A, Б – дорожка 5), HRE2 дикого типа (HRE2; А – дорожка 6, Б – дорожка 3) и мутантным HRE2 (HRE2-mut, Б – дорожка 4) олигонуклеотидами. Анализ по методу supershift провели с анти-HIF-1 моноклональными антителами (A, Б – дорожка 7). Анти-β-актин моноклональные антитела использовали в качестве негативного контроля (A, Б – дорожка 8). В – анализ иммунопреципитации хроматин промотора NCX1 головного мозга в SH-SY5Y клетках, подвергшихся воздействию 100 мкмоль/л CoCl2 в течение 24 часов, с анти-HIF-1 или антителами к иммуноглобулину G. Связывающую активность HIF-1 графически представили в виде процента от общего количества хроматина ДНК. * – р<0,05 по сравнению с контрольной группой. Каждый столбец представляет собой среднее±СОШ (n=3)

Аналогичный подход использовали для изучения сайта HRE2. Как и в случае с зондом NCX1-HRE1, полосы смещения обнаружили в экстрактах ядер клеток, подвергшихся воздействию кобальта, инкубированных с флуоресцирующим зондом NCX1-HRE2 (рис. 4Б, дорожка 2), но не в экстрактах ядер контрольных клеток (рис. 4Б, дорожка 1). Главный связывающий комплекс был вытеснен немеченым олигонуклеотидом HRE2 (рис. 4Б, дорожка 3), но не немеченым мутантным олигонуклеотидом (HRE2-mut, рис. 4Б, дорожка 4). Немеченый олигонуклеотид EPO-HRE также конкурировал с флуоресцирующим зондом NCX1-HRE2 за связывание (рис. 4Б, дорожка 5). Аналогичным образом немеченый олигонуклеотид HRE1 полностью предотвратил связывание с флуоресцирующим зондом NCX1-HRE2 (рис. 4Б, дорожка 6). Кроме того, в то время как использование моноклональных антител против HIF-1α привело к нарушению формирования комплекса с зондом NCX1-HRE2 (рис. 4Б, дорожка 7), использование анти-β-актин антител было неэффективным (рис. 4Б, дорожка 8). Для проверки фактического насыщения промотора NCX1 HIF-1 в живых клетках, мы провели анализ иммунопреципитации хроматина. Хроматин из SH-SY5Y клеток, предварительно обработанных CoCl2, структурировали и механически разделили. Затем хроматин подвергли иммунопреципитации с антителами к HIF-1 и провели ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров из региона промотора NCX1 головного мозга, содержащего гипоксия-зависимые участки. Праймеры, распознающие промотор гена эритропоэтина (ЭПО), использовали в качестве положительного контроля (данные не представлены). Как показано на рис. 4В, значительную амплификацию промотора NCX1 выше фоновых уровней получили после стимуляции кобальтом клеток нейробластомы (черные столбики на рис. 4В). В отличие от этого меньший, но все-таки значимый уровень насыщения также обнаружили в необработанных клетках (белые столбики на рис. 4C).

Также провели дополнительный анализ сдвига электрофоретической подвижности с антителами против CREB или HIF-2α. Применение анти-HIF-2α антител не предотвратило образование комплекса между ядерными белками, полученными из обработанных кобальтом клеток, и флуоресцирующими зондами NCX1-HRE1 и NCX1-HRE2 (дополнительный рис. SIA, Б, см. on-line: http://stroke.ahajournals.org). В отличие от этого на фоне применения анти-CREB антител удалось предотвратить связывание HIF-1α с его распознанными последовательностями HRE1 и HRE2, расположенными на промоторе NCX1 (дополнительный рис. SIA, Б). Кроме того, в ходе экспериментов для анализа сдвига электрофоретической подвижности, проводимых с конкурирующим олигонуклеотидом, содержащим связывающую последовательность CREB, показали, что последовательность CREB связывалась с распознающей последовательностью HIF-1α, присутствующей на промоторе NCX1 (дополнительный рис. SIБ).

Сайленсинг HIF-1αпредотвращает увеличение количества генных продуктов NCX1, индуцированное КГД

Сайленсинг HIF-1α с помощью 6 миРНК в нейронах гиппокампа позволяет предотвратить увеличение содержания белка HIF-1α (дополнительный рис. SIIA см. on-line: http://stroke.ahajournals.org), белка NCX1 и траскрипта (рис. 5А, Б), индуцированное КГД. Кроме того, две дополнительных последовательности миРНК для HIF-1α, 5 последовательностей для миHIF-1 и 7 последовательностей для миHIF-1 также были эффективны в отношении уменьшения экспрессии белка HIF-1α и предотвращения увеличения содержания NCX1 в нейронах гиппокампа, подвергшихся КГД, при этом не приводили к изменению экспрессии HIF-2α и CREB (дополнительная таблица SIIIA, Б, см. on-line: http://stroke.ahajournals.org).

Рисунок 5. Сайленсинг гипоксия-индуцируемогофактора-1 (HIF-1) привел к снижению количества генных продуктов белка натрий-кальциевого транспортера-1 (NCX1) в нейронах гиппокампа и увеличению уязвимости нейронов в условиях кислородо-глюкозной депривации (КГД). А – образец вестерн-блоттинга белка NCX1 после КГД в течение 2 часов в первичных нейронах с транзиторной инактивацией HIF-1α и в нейронах, трансфектированных нецелевой миРНК (миCTL). На диаграмме представлена количественная оценка экспрессии белка NCX1 после КГД по сравнению с показателями без КГД в присутствии миCTL или миHIF-1, выраженная в процентах от соотношения NCX1/β-актин в соответствующей контрольной группе. Б – анализ полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, демонстрирующий уровни транскрипта NCX1 после КГД в течение 2 часов в нейронах гиппокампа, временно трансфектированных миHIF-1 или миCTL. В – анализ жизнеспособности нейронов гиппокампа, подвергшихся КГД в присутствии миHIF1 и миNCX1. Число погибших клеток оценили с помощью методов, описанных в соответствующем разделе. * – р<0,05 по сравнению с контрольной группой, ** – р<0,05 vs КГД. Каждый столбец представляет собой среднее±СОШ (n=3)

Сайленсинг HIF-1αи NCX1 приводит к увеличению числа погибших нейронов после КГД

Воздействие КГД на нейроны гиппокампа в течение 2 часов привело к увеличению числа погибших клеток. Интересно, что при сайленсинге HIF-1α и NCX1 с помощью миРНК, после воздействия КГД обнаружили повышение уязвимости нейронов (рис. 5В).

Сайленсинг HIF-1 предотвращает повышение экспрессии NCX1 и нейропротективное действие, индуцированное ишемическим прекондиционированием

Для оценки патофизиологического значения увеличения транскрипции и экспрессии NCX1, индуцированных HIF-1α, определяли уровень экспрессии HIF-1α и NCX1 в коре головного мозга крыс, которым проводили ишемическое прекондиционирование головного мозга и вводили миHIF-1. Кроме того, оценивали объем инфаркта у крыс, подвергнутых тОСМА или ишемическому прекондиционированию, у которых экспрессию HIF-1α или NCX1 подавляли путем введения миРНК.

Повышение содержания HIF-1α, происходящее в коре головного мозга крыс, перенесших ишемическое прекондиционирование, было выше, чем у крыс, у которых индуцировали только ишемию головного мозга (рис. 6A). Аналогично, экспрессия белка NCX1 была значительно повышена (>200%) после ишемического прекондиционирования и тОСМА по сравнению просто с ишемией головного мозга. Интересно, что повышенная экспрессия NCX1, индуцированная ишемическим прекондиционированием и тОСМА, была подавлена сайленсингом HIF-1α (рис. 6Б). Этот сайленсинг HIF-1α носил избирательный характер, поскольку экспрессия HIF-2α и CREB не изменилась (дополнительный рис. SIIIВ, Г, см. on-line: http://stroke.ahajournals.org). Кроме того, важную роль, которую играют HIF-1α и NCX1 в нейропротекции, индуцированной ишемическим прекондиционированием и тОСМА, в дальнейшем подтвердили тем, что миРНК для NCX1 и HIF-1α привела к уменьшения объема инфаркта, индуцированного ишемическим прекондиционированием (рис. 6В). Иммуногистохимический анализ стриатума крыс, подвергнутых ишемическому прекондиционированию, показал, что в этой области головного мозга была повышена экспрессия и NCX1, и HIF-1 (дополнительный рис. SIV, см. on-line: http://stroke.ahajournals.org). В частности, при использовании анти-NCX1 антител наблюдалось интенсивное и акцентированное мечение, характерное для экспрессии в нейронах (дополнительный рис. SIV), тогда как HIF-1α обнаруживали только в ядрах клеток (дополнительный рис. SIVЖ). Интересно, что введение в желудочек головного мозга миРНК для NCX1 и HIF-1α было эффективно в отношении предотвращения повышенной экспрессии каждого белка, наблюдаемого у крыс, подвергнутых ишемическому прекондиционированию (дополнительный рис. SISF–H). Эффективность siNCX1, вводимой в желудочки головного мозга крыс, продемонстрирована на дополнительном рис. IIБ.

Рисунок 6. Сайленсинг гипоксия-индуцируемого фактора-1 (HIF-1) обратил вспять нейропротекцию, индуцированную ишемическим прекондиционированием путем снижения повышенной экспрессии белка натрий-кальциевого транспортера-1 (NCX1). А и Б – образцы вестерн-блоттинга уровня белков HIF-1 и NCX1 в коре ложно-оперированных животных (CTL), крыс, подвергшихся транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (тОСМА) в течение 100 минут с последующей реперфузией в течение 24 часов, крыс, подвергнутых тОСМА в течение 30 минут, затем через 72 часов – тОСМА в течение 100 минут и реперфузии в течение 24 часов (ПК+тОСМА) и крыс, которым вводили миHIF-1 в желудочек головного мозга (6), а потом подвергали тОСМА в течение 30 минут, затем через 72 часа – тОСМА в течение 100 минут и реперфузии в течение 24 часов (ПК+тОСМА+миHIF-1). * – р<0,05 vs CTL; ** – р<0,05 vs всех экспериментальных групп. Каждый столбец представляет собой среднее±СОШ (n=3). В – объем инфаркта у крыс, подвергшихся тОСМА, ПК+тОСМА, ПК+тОСМА+миCTL, ПК+тОСМА+миNCX1 и ПК+ тОСМА+миHIF-1. Образцы срезов головного мозга представителей каждой экспериментальной группы представлены в верхней части каждой колонки. Крыс с ишемией умертвили через 24 часа после тОСМА. * – р<0,05 vs тОСМА; ** – p<0,05 vs все экспериментальные группы. Каждый столбец представляет собой среднее±СОШ (n=5–7) в процентах от объема инфаркта по сравнению с объемом ипсилатерального полушария

ОБСУЖДЕНИЕ

Насколько нам известно, результаты нашего исследования впервые продемонстрировали, что ген, кодирующий убиквитарный белок Na+/Ca2+ транспортер-1 NCX1 можно включить в семейство генов, активируемых фактором транскрипции HIF-1. Эта регуляция приобретает особую актуальность в свете недавно установленной роли HIF-1 и NCX1 в некоторых патофизиологических процессах при ишемии головного мозга. Известно, что нейрон-специфическая инактивация HIF-1α активирует повреждение головного мозга после тОСМА, что позволяет предположить наличие у HIF-1α нейропротективного действия [23]. Аналогичным образом стратегия использования антисмысловых олигодезоксинуклеотидов для инактивации NCX1 приводит к увеличению зоны инфаркта после стойкой ОСМА [20]. Примечательно, что в областях, окружающих ядро ишемии, происходит повышение регуляции уровня транскрипта NCX1 [24]. В связи с этим HIF-1-зависимая повышенная регуляция экспрессии NCX1, которую обнаружили в данном исследовании, является дополнительным механизмом сохранения жизнеспособности клеток, характерного для HIF-1.

В настоящей работе тесную связь между транслокацией HIF-1 в ядро и повышенной экспрессией NCX1, а также патофизиологическое значение этих процессов продемонстрировали с помощью доказательств того, что повышенная экспрессия HIF-1, индуцированная КГД или воздействием CoCl2, и ишемическое прекондиционирование головного мозга приводят к увеличению количества генных продуктов NCX1, что в свою очередь сопровождается соответствующим нейропротективным действием.

Другим важным результатом исследования было выявление двух активных функциональных участков, возникающих в шести предполагаемых консенсусных последовательностях HRE. Анализ сдвига электрофоретической подвижности, анализ по методу supershift и анализ иммунопреципитации хроматина показали, что связывание HIF-1 с HRE1 и HRE2 было очень избирательным и вызывало транскрипцию гена NCX1, о чем свидетельствует увеличение активности люциферазы, индуцированное CoCl2.

Кроме того, удалось продемонстрировать, что CREB связывался с последовательностями распознавания HIF-1, присутствующими на промоторе NCX1. Однако при ишемическом прекондиционировании экспрессия HIF-1 и NCX1 была значительно повышена, в то время как экспрессия CREB не изменилась, в связи с чем можно предположить, что потенциальная связывающая способность CREB на HRE, по всей видимости, не участвует в регуляции экспрессии гена NCX1.

Патофизиологическая значимость молекулярной связи, существующей между HIF-1 и NCX1, четко подтверждена результатами нашего исследования, проведенного с использованием модели ишемического рекондиционирования у животных, в которой повышенная регуляция NCX1 была подавлена при сайленсинге HIF-1. В отличие от снижения экспрессии NCX1, которое наблюдается при ишемии in vivo, после КГД может развиться HIF-1-индуцированная повышенная экспрессия NCX1. Однако следует учитывать, что: (1) при экспериментах in vitro экспрессию белка NCX1 определяли только в нейронах, а не в нескольких популяциях клеток, поскольку повышение экспрессии происходит в гомогенатах всех тканей мозга, содержащих нейроны, астроциты, глию и другие клетки мозга; (2) временнoй интервал в двух экспериментальных моделях отличается, поскольку в модели in vitro экспрессию NCX1 и HIF-1 регистрировали через 2 часа КГД, в то время как в модели in vivo экспрессию регистрировали после тОСМА продолжительностью 100 минут с последующей реоксигенацией в течение 24 часов. Это соответствует результатам нашего предыдущего исследования продемонстрировавшего, что in vivo экспрессия NCX1 через 3 часа после ОСМА не уменьшилась, в то время как ее снижение зарегистрировали через 6 и 24 часа [20]. Кроме того, недавно с помощью иммуногистохимии удалось показать, что после ОСМА повышение сигнала иммунореактивности NCX1 происходит только в определенных зонах ядра ишемии, таких как спиральные апикальные дендриты и сома нейронов, расположенных в глубоких слоях коры, в то время как сигнал NCX1 значительно снижается в зоне ядра [10], вероятно, в результате протеолиза [25]. Эти последние данные могут объяснить, почему в данном исследовании при вестерн-блоттинге гомогенатов ишемического ядра обнаружили снижение экспрессии NCX1, хотя в отдельных популяциях клеток головного мозга в зоне инфаркта регуляция NCX1 повышается.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В совокупности результаты нашего исследования демонстрируют, что в головном мозге крыс NCX1 является новым геном-мишенью для HIF-1. Кроме того, нам удалось показать, что HIF-1 во время ишемического прекондиционирования играет роль в сохранении жизнедеятельности клеток путем повышения транскрипции гена NCX1 и экспрессии белка, нейропротективное действие которого было полностью доказано в последних исследованиях [14, 20, 26, 27].